欧坦涅斯代替美伽帕佐斯出任色雷斯总督，他出兵攻占了赫拉斯庞特海峡南北的许多海上要地。这样，从黑海到爱琴海的所有交通和贸易重地，比如分处博斯普鲁斯海峡两岸的拜占廷和卡尔赛敦，赫拉斯庞特海峡在爱琴海出口处的列木诺斯岛和音布罗斯岛，还有安塔多洛斯港。此时，波斯军队已完全扼住了自黑海北岸南下到希腊的粮食运输线。同时，在海上商贸方面，黑海地区一直是爱奥尼亚各希腊城邦的重要贸易伙伴，大流士此举无疑控制了爱奥尼亚的海上经济命脉；这时候，已归顺波斯帝国的腓尼基人也屡屡与希腊人抢夺控制权。形势所迫，希腊城邦不得不采取措施来保护自己的利益。公元前500年，被波斯帝国统治已达50年之久的小亚细亚希腊城市发动叛乱，以米利都为首，他们罢免大流士派去的行省总督，纷纷自立。
此时的米利都僭主是西斯提亚欧的女婿阿利斯塔哥拉，因为西斯提亚欧已被大流士召到苏萨，他一直想回到米利都，所以盼望米利都人叛乱而趁机回归。所以，他悄悄送密信给阿利斯塔哥拉，支持女婿立即起兵造反。阿利斯塔哥拉为拉拢希腊百姓，主动放弃僭主职位，在米利都建立起民主政体，并强制爱奥尼亚各地僭主予以仿效。之后，他前往一直以陆军强悍而闻名全希腊的斯巴达，意欲寻得援助。他先向斯巴达王刻利奥美尼陈说爱奥尼亚正面临着灭顶之灾，又说波斯人是多么的不堪一击，并夸耀了一番波斯帝国如何地大物博，言下之意，一旦打败波斯帝国，便可富甲天下。他讲完后，刻利奥美尼问他征讨波斯的路上要花多长时间，后者回答三个月，斯巴达王立即说：“我们的军队不会走这么远作战的。”于是，碰了一鼻子灰的阿利斯塔哥拉只得败兴而归。
向斯巴达求助无门，阿利斯塔哥拉又来到雅典。此时的雅典在刻莱赛尼兹的带领下，也已脱离僭主的统治，享受着民主的平等。原来的雅典僭主西匹亚斯流亡在外，他想回到雅典重新当政，于是，便去小亚细亚求见吕底亚的波斯总督阿塔佛列涅，请求波斯人发兵帮助他回国执政。阿塔佛列涅要求雅典人接回西匹亚斯，但遭到拒绝。就在这个关键时刻，阿利斯塔哥拉前来雅典求援，自然是有求必应。
面对雅典人，阿利斯塔哥拉又重复了一遍曾经对斯巴达王的游说之辞，然后又强调米利都人与雅典人同为希腊人，如今同胞有难，恳请雅典人发兵援助。在得到雅典人的肯定答复后，阿利斯塔哥拉立即返回米利都。公元前499年，爱奥尼亚人和雅典人、艾莱特利亚人在以弗所举兵，攻向吕底亚的总督所在地萨迪斯。一开始，战事进行得很顺利，吕底亚总督阿塔佛列涅率军退至萨迪斯卫城，居高临下与起义军对峙。这时，起义军点燃了房屋，火势蔓延开来，竟殃及库伯勒女神庙。在熊熊大火中，吕底亚守军奋力突围，跑至城外，与前来追赶的起义军展开肉搏战。有道是穷寇勿追，此时的吕底亚守军背水一战，竟将起义军打得落花流水。起义军不敌撤退，至以弗所时，与弗里吉亚的波斯增援军队交战，起义军大败，艾莱特利亚统帅战死，艾莱特利亚人和雅典人分别逃回家园，只剩下爱奥尼亚人孤军奋战。
虽然身处逆境，爱奥尼亚人却越战越勇，他们一边向北攻占赫拉斯庞特海峡和拜占廷，一边鼓动小亚细亚南部的卡里阿斯和塞浦路斯岛起兵反抗波斯统治，并收效良好。
当与爱奥尼亚的战况传到大流士那里时，他火冒三丈，向阿胡拉·玛兹达祈求，请神允许他报复胆敢出兵侵犯波斯的雅典人。而且，他命令身边侍从，每逢他吃饭时，都要连续三遍提醒他不要忘记雅典人加于他的耻辱。然后，大流士在苏萨做战略部署。他派道里赛斯率军夺回赫拉斯庞特海峡的控制权，令其成功后挥师南下征服卡里阿斯人；对于塞浦路斯岛叛乱，大流士派出两路人马，陆军由阿耳提庇欧率领，自西里西亚渡海南下进攻塞浦路斯岛的北方城市萨拉弥斯，同时，腓尼基的波斯海军从海路出发协助陆军。
接到大流士的命令，波斯军队南北全线出动。北面的道里赛斯五天内连续攻克五座城市，这五座城市由北向南部分控制了赫拉斯庞特海峡南岸的海上交通线路。然后，道里赛斯将继续扩大赫拉斯庞特海峡控制权的任务交给继任者绪马伊斯，自己率兵南下卡里阿斯平叛。绪马伊斯又征服了特洛伊等地，但不久即病死。
在卡里阿斯，道里赛斯率领的波斯军队大败叛军，杀死敌军过万，自己也损失两千余人。赶来增援的米利都人与卡里阿斯人兵合一处，结果又被波斯军队打败。即便如此，卡里阿斯人仍坚持作战，他们在波斯军队往东面爱琴海沿岸城市佩达索斯行军的路上设伏，一举歼灭道里赛斯军队，道里赛斯也英勇战死。
就在道里赛斯大军消灭叛军的同时，塞浦路斯岛上也打响了战斗。阿耳提庇欧率陆军在萨拉弥斯登陆，与岛上叛军交战；同时，腓尼基的波斯海军与前来增援的爱奥尼亚海军也加入战团。最后，波斯陆军战胜，但主帅牺牲；波斯海军却大败。接下来，波斯军队重整旗鼓，最终用了五个月终于消灭了塞浦路斯岛的叛乱势力。
公元前494年，波斯大军最后总攻的时刻终于到了。波斯陆军在米利都城郊外排开阵势，海军的600艘战舰则密布于拉德湾，与米利都的300多艘战舰对峙。波斯统帅找来流亡在外的原爱奥尼亚僭主们，命令他们给起义军内的各城邦将士写信，让他们早日归降波斯帝国，以获得大流士国王的宽恕；如果他们坚持与波斯为敌，那么后果只有被杀，他们的家人也将被卖为奴隶。波斯统帅如此做法，虽然没能立即奏效，但接下来却起到了至关重要的作用。
西斯提亚欧
道里赛斯战死后，大流士派出欧坦涅斯。欧坦涅斯立即南下，攻占爱奥尼亚北部要地库迈和刻拉左门尼，向米利都扑来。此时，阿利斯塔哥拉无计可施，只得向色雷斯的弥耳西诺进军。弥耳西诺曾被大流士赏给阿利斯塔哥拉的岳父西斯提亚欧，这里银矿和木材遍布，且保留着西斯提亚欧建造的防御工事。当初西斯提亚欧之所以被调离这里，就是因为此地物产丰富，且地理位置优越，这样的地方落入非波斯人手里很容易对大流士政权造成威胁。阿利斯塔哥拉正因此选中此地，作为他东山再起的根据地。可是，当他去进攻色雷斯人时，却壮志未酬身先死。阿利斯塔哥拉死后，西斯提亚欧瞒过大流士潜回米利都，打算重新以僭主身份统治米利都人，但遭到正沐浴着民主之风的米利都人的拒绝。无奈，他只得北上占据拜占廷，等待时机重返故土。
当波斯海军发起总攻时，作为米利都舰队主力的撒摩斯人和列斯堡人望风而逃，仅留下米利都人和凯厄斯人奋力抵抗，终因寡不敌众而溃退。公元前494年11月，波斯军队攻入米利都城，对城内男性大肆屠杀，其余人等则被送回帝国中心卖做奴隶。历时六年之久的爱奥尼亚叛乱终于烟消云散，而那位伺机恢复政权的西斯提亚欧，则在后来的起事中被杀。就这样，爱琴海东部沿岸岛屿又重归波斯帝国辖内，爱琴海和黑海的海上控制权也落到了大流士的手里。
不过，大流士的侍从仍然每逢国王用餐时，连续三次地提醒他希腊人的存在。爱奥尼亚叛乱虽已平定，但大流士已酝酿好对希腊发动战争。
